ПЛР має три основні етапи, які включають процес нагрівання та охолодження: Крок 1, денатуруючий: дволанцюгова матрична ДНК нагрівається, що розділяє її на дві одинарні нитки. Етап 2, відпал: температуру знижують, щоб праймери ДНК могли приєднатися до матричної ДНК.
ПЛР базується на трьох простих кроках, необхідних для будь-якої реакції синтезу ДНК: (1) денатурація шаблону на окремі нитки; (2) відпал праймерів до кожного вихідного ланцюга для синтезу нового ланцюга; і (3) подовження нових ланцюгів ДНК з праймерів.
Один із методів передбачає включення стадії RT у ту саму пробірку, що й реакція ПЛР (одноетапна). Інший метод передбачає створення кДНК спочатку за допомогою окремої реакції зворотної транскрипції, а потім додавання кДНК до реакції ПЛР (двоетапна). Обидві системи мають переваги та недоліки.
Процес ПЛР складається з 4 етапів:збір, підготовка, ампліфікація та очищення після ПЛР. Етапи ПЛР-машини відбуваються на етапі ампліфікації. Він починається із сегмента зразка ДНК, який поміщають у відповідну пробірку разом із реагентами та хімікатами, перерахованими вище.
Отже, послідовність кроків така денатурація, відпал і розширення.
RT-PCR можна проводити в одноетапний або двоетапний аналіз. Одноетапні аналізи поєднати зворотну транскрипцію та ПЛР в одній пробірці та буфері, використовуючи зворотну транскриптазу разом із ДНК-полімеразою. Одноетапна RT-PCR використовує лише специфічні для послідовності праймери.