До складу Gibson Assembly Master Mix входить три різні ферментативні дії, які виконуються в одному буфері: Екзонуклеаза створює одноланцюгові 3´ виступи, які полегшують відпал фрагментів, які мають спільну комплементарність на одному кінці (область перекриття).
Основна суміш Gibson Assembly (ізотермічна реакційна суміш) складається з три різні ферменти в одній буферній суміші та додатковий білок SSB для підвищення точності та ефективності.
Gibson Assembly використовує три ферментативні активності в реакції в одній трубці: 5´ екзонуклеаза, 3´ подовжуюча активність ДНК-полімерази та активність ДНК-лігази. Активність 5´ екзонуклеази пережовує 5´ кінцеві послідовності та піддає комплементарну послідовність для відпалу.
У збірці Гібсона активними ферментами є Т5 екзонуклеаза, полімераза Phusion і лігаза Taq. Ці ферменти працюють разом, щоб злити фрагменти ДНК, що перекриваються. Екзонуклеаза T5 віджовує 5'-кінець дволанцюгової ДНК, щоб виявити сконструйовані перекриття.
Під час будь-якої реакції збірки Гібсона буде з’єднано один із двох типів фрагментів ДНК, або ПЛР фрагмента рестрикції. Конструкція праймерів для створення накладень змінюється залежно від того, які фрагменти з’єднуються.
Майстер-мікс зазвичай включає ДНК-полімераза, dNTP, MgCl2 і буфер. Використання майстер-міксу зменшує дозування та ризик забруднення, є зручним, економить час і запобігає можливим помилкам під час змішування, що робить його ідеальним для застосування з високою пропускною здатністю.